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http://ciad.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1006/1225| CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS, CINÉTICAS Y ESTRUCTURALES DE LAS LDH-1 Y LDH-2 RECOMBINANTES DE CAMARÓN BLANCO Litopenaeus vannamei | |
| MAGALLY LUISA ELENA HERNANDEZ PALOMARES | |
| Elisa Miriam Valenzuela Soto | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución-NoComercial-SinDerivadas | |
| La lactato deshidrogenasa (LDH) es una enzima clave en la glucólisis anaerobia. En el camarón L. vannamei, existe un gen para la LDH que mediante splicing alternativo produce dos isoenzimas: LDH-1 y LDH-2. El objetivo de este trabajo fue caracterizar bioquímica y cinéticamente a la LDH-1, y analizar las características estructurales de la LDH-1 y LDH-2. La LDH-1 se sobreexpresó en Escherichia coli utilizando el medio de cultivo Native Folder Bacterial. La temperatura y pH óptimos de la LDH-1 se determinó variando pH y temperatura. Se midió la actividad enzimática de las enzimas en presencia de cationes y se utilizaron sustratos análogos al piruvato para analizar la especificidad. Se realizaron patrones de velocidad inicial con cada sustrato para las constantes cinéticas. Los modelos estructurales se obtuvieron utilizando el programa MOE. La LDH-1 tiene una masa molecular de 140 kDa, mayor afinidad por piruvato; pH y temperatura óptima de 7.5 y 44°C; estable a pH entre 8.0-9.5 y 20-36°C. Se obtuvieron dos pKa de 6.1± 0.15 y 8.8 ± 0.15 sugiriendo que la histidina y la asparagina están involucradas en el sitio activo de la LDH-1. NaCl2 y KCl2 aumentaron la actividad solo de la LDH-1, CuCl2, ZnCl2 y CdCl2 inhibieron a ambas enzimas. Los análisis de dosis-respuesta mostraron que zinc y cadmio presentan mayor IC50 en la LDH-2 que en la LDH-1. Los análisis estructurales indican que existe un mayor número de sitios de unión para cadmio en la LDH-2. Ambas enzimas reconocen a los sustratos análogos al piruvato. El análisis de los patrones de velocidad mostró un patrón de líneas de un mecanismo cinético secuencial. LDH-1 tiene una Km = 45 μM para NADH y 85 μM para piruvato, y Vmax = 11.0 μmol/min/mg de proteína. Ambas LDHs presentan los mismos aminoácidos catalíticos: D (166) R (169) y H (193). La LDH-1 es inhibida por NADH. Se encontraron diferencias en la estructura secundaria LDH-1 contiene 30% alfa hélice, 7% hoja beta, 33% rizo y 30% de ambigüedad y LDH-2 28% alfa hélice, 11% hoja beta, 36% rizo y 25% ambigüedad. Se observaron diferencias en la estructura terciaria, en donde se detectaron cambios en el acomodo tridimensional de las proteínas. Se infiere que los 15 aminoácidos diferentes están jugando un papel en las diferencias bioquímicas, cinéticas y estructurales. De los 15 aminoácidos, al menos 5 de ellos son diferentes químicamente, por lo que pueden ser los que estén influyendo en dichos cambios. | |
| 25-10-2023 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| CIENCIAS AGROPECUARIAS Y BIOTECNOLOGÍA | |
| Aparece en las colecciones: | TESIS DE DOCTORADO EN CIENCIAS (DC) |
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