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http://ciad.repositorioinstitucional.mx/jspui/handle/1006/1216| VALIDACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE UN EPÍTOPO DE LA ARGININA CINASA DE GARRAPATA CAFÉ DEL PERRO (Rhipicephalus sanguineus), POTENCIAL BIOMARCADOR DE EXPOSICIÓN | |
| ANA CAROLINA GOMEZ YANES | |
| ROGERIO RAFAEL SOTELO MUNDO | |
| Acceso Abierto | |
| Atribución-NoComercial-SinDerivadas | |
| Rhipicephalus sanguineus tiene la capacidad de transmitir patógenos, entre ellos a Rickettsia rickettsii, causante de la Fiebre Manchada de las Montañas Rocosas. En México, es una enfermedad reemergente con alta tasa de mortalidad. Un biomarcador de exposición a garrapata permitiría encontrar áreas de la población con mayor exposición a este vector; localizadas estas áreas, se podrían implementar estrategias de control más eficientes, disminuyendo incidencias de la enfermedad. La arginina cinasa (AK) es una enzima vital en el metabolismo de invertebrados y se ha propuesto como biomarcador de diversas enfermedades; sin embargo, es una proteína bastante conservada entre especies, por lo que estudiar sus epítopos podría ayudar a determinar si pudiera ser usada como biomarcador de exposición. Para esto, se determinó la estructura cristalográfica de la arginina cinasa de Rhipicephalus sanguineus (RsAK) mediante difracción de monocristal utilizando rayos X a una longitud de onda de 1.19 Å. Adicionalmente se aplicó la técnica de SAXS para estimar el tamaño de la molécula en solución. Con la estructura tridimensional, se predijeron epítopos especie-específicos con ayuda del algoritmo de DiscoTope 2.0. Las secuencias predichas por el algoritmo se mutaron a alanina en secuencias separadas, utilizando genes sintéticos para cada variante. Tanto la secuencia silvestre de la garrapata (wild-type, WT), como las mutantes, fueron sobreexpresadas en Escherichia coli, se purificaron mediante IMAC y SEC, se comparó su actividad enzimática específica, y se realizó un ELISA, para el cual se utilizaron sueros de pacientes diagnosticados positivos a FMMR. Se resolvió la estructura cristalográfica de la RsAK en ausencia de ligandos (apo) con una Rwork de 15.52 y una Rfree de 18.57. Mediante SAXS, se encontró que la RsAK tiene un radio de 80 Å en su conformación apo y 60 Å en TSAC. Se predijeron 4 epítopos especie-específicos (E1, E2, E3 y E4). Se sobreexpresaron de manera soluble y purificaron la WT y las mutantes E1 y E2. En los ensayos de actividad enzimática se vio una disminución significativa en la actividad en la mutante E2. Además, se encontró una disminución significativa (p<0.05) en la reactividad en los sueros contra la E1, lo cual sugiere que E1 es un epítopo conformacional verdadero, que se conforma por un lazo y una alfa hélice y está en la superficie del antígeno. | |
| 01-09-2023 | |
| Tesis de doctorado | |
| Español | |
| BIOLOGÍA Y QUÍMICA | |
| Aparece en las colecciones: | TESIS DE DOCTORADO EN CIENCIAS (DC) |
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